qPCR based CCS比 aCGH更準確 !!
CCS胚胎染色體的
全基因檢測6種PGS 平台 大PK:FISH CGH aCGH qPCR SNP NGS :qPCR based CCS比 aCGH更準確 !!
全世界第一例試管嬰兒在1978年誕生叫路
意
絲
布朗，
但事實上在更早1967年艾德華就用兔子的胚胎去做公兔、母兔
的性別
PGD，
這個實驗還比試管嬰兒提早了11年，
試管嬰兒也2010年得到諾貝爾醫學獎，
但我們面臨的是
女人
隨著年紀的增加，胚胎或卵子的染色體異常比率會增加，尤其是
女人
超過35歲以後，
染色體
3套體比率像沖天炮一樣沖到35%以上，
這個研究證實年紀愈大胚胎3套體的比率會增加，
美國CDC的統計也發現年紀超過35歲以上，試管嬰兒成功率活產率也愈來愈低，尤其是超過42歲幾乎是
個
位數，這是2010年的統計。
從2001年到2010年美國這10年來植入胚胎數，
統計
從
植入胚胎
1個、2個、3個或4個以上，尤其是植入4個胚胎或超過4個，從
2001年的
12%降到
2010年的
1%，
可見美國在沒有人工生殖法的限制下，即便是在2010年，
仍然有
1%
(1600個)
植入
4個胚胎以上，
美國1年16萬次試管嬰兒，
因為胚胎植入數增加，使得新生兒合併症
：
早產或低體重
雙胞胎是59.4%，
在2007年(民國96年)之前人類對於胚胎染色體篩檢檢查，
那一年美國生殖醫學會指導綱領提出目前的醫學證據不
支持
例行性的使用PGS，
那時候是第3天切片使用FISH，
那一年也提出了叫做
有名的：
莫生布魯克爭議，
其中最主要的是第三天胚胎會減少懷孕率，
但是這7年當中變化太大，如2008年的基因晶片a-CGH，
2009年Simon Fishel
費雪
第1例
a
CGH寶寶誕生，
美國紐澤西團隊在2010年使用SNP，冷凍胚胎獲得驚人的
懷孕
成績，
他們更在2012年推出qPCR
技術2013年發表植入2個
qPCR
懷孕率94.7%，
所以篩檢胚胎從已經被淘汰的FISH，
到2007年~2008年的CGH、aCGH微陣列基因晶片，
2010年的SNP單核甘酸多樣性，
2012年即時定量多重酶聚合反應，
和2013年已經有報導的次世代定序，
這6個檢查胚胎染色體的平台，
我們要分胚胎頂多
切片
3個
胚葉
細胞~6個細胞，
這時候胚胎DNA的量大概只有2X負
12
次方到2的負10次方量，
以我們所需要檢查DNA所需要的量為2X10負6次方
，遠遠不
足
夠因此要做基因放大，因此你要做SNP、a-CGH、NGS，都必須要透過基因放大。
我們看一下SNP、qPCR、aCGH的胚胎PK，
如果用SNP他用基因放大之後，
把檢測的胚胎和對照組使用電腦去比較DNA，
目前公認SNP是用檢查胚胎的黃金準則，
但是SNP貴又時間久要3天半，
可是它告訴我們胚胎整倍不整倍，他也一樣要做雙重，
也就是說檢查胚胎需要對照組胚胎正常的染色體，
那如果是aCGH一樣經過PCR基因放大，
但是他釋放在一個基因晶片上面，
檢測的DNA和對照組的DNA去做競爭，
所以CGH的C就是競爭，
aCGH出來的曲線就像是股票的曲線有高、有低，
高出來的就是多一套染色體
低下去的就是少一套染色體，
最新的是NGS次世代定序相較於傳統基因定定序的好處是大量平行性的定序，
大可以取得3個資訊：
1.胚胎的染色體、
2單基因疾病、
3.粒線體的基因突變，
NGS次世代定序一樣需要把DNA做放大，
兩倍再結合，
在跟對照組DNA這個需要電腦去做判讀，
但出來的訊號非常的複雜，需要用software
程式
去做annalysis。
2013年已經有4篇NGS
用在PGS
在美國生殖醫學會ASRM
年會
去做發表，
包括1份海報、3份口頭報告，
其中注意來自於義大利羅馬團隊，口頭報告270篇他對次世代定序驗證，
CCS胚胎著床前染色體檢查要用到病人身上前，一定要做臨床的驗證validation。
2012年的qPCR做胚胎的囊˙胚切片，
經過高溫分離兩股DNA，
在放到qPCR的儀器96、384、1536 wells ，
經過分析只要4個小時，
有快、便宜、彈性的好處，
而且不用全基因放大，
他只需要的設計定點放大，
2012年經過Nathan Treff
(
RMANJ
)
驗證後2013年發表臨床的應用，
qPCR如果某段基因多或少就會在儀器上顯示出不同的顏色，
比如說這張qPCR圖 (fig-1)16對染色體、21對染色體多了唐氏症，就會呈現淺黃色，因為它的染色體數目是多了，
反觀如果在在性染色體X或Y是紅色，因為他染色體只有1套，所以可以很清晰看到16.、21染色體是3套，再用2008年的一份公式去算，
經過電腦分析可以算出和aCGH一樣、
和SNP一樣，多出來看的出來。
在臨床上做CCS一定要有3個特點：
1.臨床前要很準確。
2.做切片不傷到胚胎也就是安全。
3.臨床上要有它的有效性，
比如說
沒有疾病的要增加胚胎著床率、懷孕率，這叫有效。
我們把SNP、qPCR、aCGH來做對比，
發現SNP很準確，都有98.6%的正確率，
那qPCR呢？有97.6%，兩者差不多，
如果胚胎用qPCR、SNP，發現他們報告幾乎是很吻合，
98.6%是吻合多很高的，
當然用以前老舊的方法FISH和SNP去做對比，SNP一下子就把FISH打敗，
臨床上第3天切片和第5天切片，會有第3天切片減少39%著床率。
那我們怎麼去預測這個檢測方法的臨床價值，
也就是診斷正確不傷胚胎而且要增加懷孕率，
在預測第3天切片的準確度，
CCS的陽性預測率也就是胚胎正常，後來也是正常，大概在29.2%到18%，
第3天胚胎是29.2%，
第5天胚胎是48.2%，
那如果說是這胚胎染色體是異常第3天是98.1%，
第5天是93.5%的正確率，
這個數據顯示第3天切片是有胚胎染色體鑲嵌的風險，
有一個研究找來55個囊胚，
先經由aCGH證明染色體的異常，
再切一次用qPCR，
qPCR說這裡面有48個異常，
但是有7個他認為正常，
這7個用SNP來做公正裁判，
發現有5個和qPCR看法一致，
但是有2個3個檢查是不一致，
TREFF
由此可見可以做出一個結論 : qPCR比aCGH更準確，
在這個優越的基礎上，
2013年義大利團隊做出來的口頭論文，
在他們發表幻燈片上面同一個胚胎，
SNP和qPCR都認為46XY正常，
aCGH卻是說它是45XY，
第8對染色體少一根，顯見qPCR比aCGH準確，因此在SNP、qPCR和aCGH，
尤其qPCR和aCGH上，
我們發現qPCR錯誤率是0，
但aCGH錯誤率是9%，
這兩個是有統計學上的差異，
當你有兩個胚胎3個檢查看法不一致。
那什麼情況下病人要用CCS？
當然胚胎的安全是第一要務，
也就是說你切下去不會傷到胚胎，
請記得那時候有一個倫敦血友病是
在
胚胎第3天胚胎片，
用
男女
性別去區分有或沒有
血友病
，那是1990年翰迪賽
HANDYSIDE
，
那是人類第一個PGD成功的案例，
1967年是兔子的胚胎，
可是第3天切片會傷到胚胎，
而哪一切片才不會傷到胚胎？
有一個數據可能會讓你嚇了一跳，在2010年歐洲生殖醫學會統計有申報的胚胎切片案例，2萬1千794個都是第3天切片，只有58個是
第五天
囊胚期胚胎切片，那是4年前的事情，但是現在的證據顯示，尤其是2013年紐澤西團隊思考特他發現第3天胚胎切片著床率少了39%，第5天不會，這份報告數據出來豈不是把2010年歐洲生殖醫學會狠狠打
臉
。
臨床上CCS一定要有他的有效性，而且你說有效一定要有數據顯示，醫學上就是要有隨機的臨床對比，第1份的RCT的報告顯示用單一胚胎著床率有做CCS是80%，沒有做是61%，而活產率有做的是64%沒有做的是48%，這有統計學上的差別，在2013年的72個qPCR，24條染色體的分析，植入2個胚胎，臨床懷孕率94.7%、活產率84.7%，相較於兩個胚胎沒有做切片。
囊胚外觀正常活產率68%，同樣的在2012年佛曼的研究，小於35歲做CCS他植入1個胚胎活產率是71.4%，沒有做切片47.2%，如果1個有做切片，相當於兩個沒有做切片的活產率，活產率65%，這是第2份RCT的研究，但是單胞胎的比率一個有做切片100%單胞胎，兩個沒有做切片的46%雙胞胎、2%3胞胎，植入兩個胚胎變成3胞胎，這個對於減少多胞胎是有意義的。
RMANJ的
Nathan Treff納森催夫做出7點結論：
1. qPCR based CCS要有正確性，經過雙盲的研究證實那是正確的。
2.qPCR based CCS是穩定的也就是不管怎麼做他是固定的準確率和懷孕率。
3. qPCR based CCS可以可以可以看染色體也可以看單基因疾病平衡轉位。
4.qPCR based CCS是安全的不傷胚胎。
5.qPCR based CCS是有效的改善提高懷孕率。
6.qPCR based CCS他是有效的放一個胚胎而不影響懷孕率。
7.催夫認為至少在他們RMANJ 是廣泛的應用。
在2012年紐澤西團隊他們PGD案例是25%，
2013年是32%，
紐澤西團隊他們試管嬰兒一年是2000個週期，
未來的CCS無疑是次世代定序，兩個理由：
1.便宜、
2他同時也可以看單基因疾病，
一個病人他有單基因疾病如多囊腎，
第5天切片既可以看多囊腎又可以看24個染色體，
目前所有的平台只有次世代定序是可以看到。
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